中晚期非小细胞肺癌首创性药物索托拉西的艰辛历程：让KRAS“不可成药”靶点魔咒成为历史

2021年5月28日，美国FDA根据索托拉西临床II期的安全有效性结果，批准其上市，索托拉西成为治疗携带KRASG12C变异的中晚期非小细胞肺癌的首创性药物，引起业界瞩目。KRAS是一种致癌基因，蛋白Gly12容易发生变异Cys12，大约40年前科学家就已揭示KRAS变异与肿瘤的关系，但多年来研究进展缓慢。安进（Amgen）迎难而上，基于片段的药物设计（FBDD）方法和共价结合（Covalent Binding）原理，将药物共价结合于Cys12上，锁定KRAS为不可逆的非活化构象状态，突破了KRAS非可药性靶标的思想束缚，开发出全球首创的以KRASG12C为靶标的小分子靶向药物——索托拉西。

1 研发背景

30%的肿瘤是由于癌基因KRAS突变引发的，是肺、结肠和胰腺癌等常见的肿瘤驱动基因，尤其在肺癌中，20%的KRAS蛋白Gly12变异成Cys12（KRASG12C）。研发KRAS蛋白突变与癌症的相关性已有三十多年之久，但学界和企业界一直没有研制出药物，主要原因是成药性差。一是因为KRAS与GDP和GTP酶的结合力非常强，外来的抑制剂很难达到与GDP和GTP酶发生竞争性结合的强度；二是KRAS蛋白的结构缺乏其他的疏水腔穴，缺乏设计抑制剂的抓手。

为了能找到可结合KRAS中蛋白Cys12的苗头化合物，Ostrem等基于片段药物设计并筛选和评价了380个二硫键衍生物对KRAS-GDP标签性结合力，用质谱检测全蛋白的MS信号，发现化合物2E07（1）和6H05（2）具有较强的结合能力（结合能力：6H05>2E07）。 故以6H05（2）为起始物进行先导结构的演化，得到活性更强的化合物3。

 

 

通过化合物3与KRASG12C共晶结构发现，3没有结合在核苷酸结合腔中，而是在变构区的疏水性沟槽上，即KRAS-GDP变构区域的S-IIP处，将KRAS构象固定在非活化状态，并延伸到Cys12以外的区域中，3的胺基与Gly60羰基形成氢键。

 

 

二硫键是较弱的亲电性基团，为提高抑制活性，将二硫结构优化为亲电性更强的丙烯酰胺和乙烯基磺酰胺，这类衍生物都呈现活性，但乙烯基磺酰胺的亲电性强于丙烯酰胺而导致选择性差，因而优化了丙烯酰胺系列。其中化合物4是以哌嗪为连接基，LC-MS-MS确证与KRAS的Cys12发生了共价结合，经生化方法测定发现，化合物4抑制KRASG12C的速率常数{kobs/[I]=0.1(mol·L-1)-1·s-1)}显示出一定的活性。进一步优化活性和过膜性，得到化合物5，活性和成药性均得到显著改善。

 

 

2 先导化合物的发现

安进为了加快研究KRAS抑制剂步伐，与Carmot Therapeutics公司合作，利用Carmet的化学型演化（chemotype evolution）技术平台，设计合成了20000多个单体分子，并使用生化和质谱方法评价了化合物的结合性能，从而得到新的苗头化合物6。

2.1 母核的固定

随后将酰胺基与溴代苯酚环合为吲哚以固定母核的构象，作为探索优化先导物的路径，结果表明，变换吲哚3-位连接的末端片段对活性有一定的影响，但不显著，其中化合物7的抑制活性最好{Cell pERKc 4h: IC50=11.4 μmol·L-1}。

 

 

2.2 化合物7结构优化

 

 

 

化合物14对细胞抑制活性最好，但是对啮齿类的口服生物利用度较低，体内的清除率却很高，故仍需作进一步优化。

3 先导化合物结构优化

3.1 骨架融合

由于化合物14是经过各片段优化而得到的，要想进一步提高其成药性，只能另辟蹊径。科学家从分析化合物与KRASG12C的结合模式入手，发现化合物14和15都是定位于KRASG12C的变构区S-II区域，通过叠合化合物14和15 的活性构象，发现在化合物14的N1位连接出疏水片段，相当于15的四氢异喹啉所占的位置，因而合成了以酞嗪为母核的新类型化合物。

 

 

 

 

相较于化合物15，化合物23生化和细胞活性分别提高了3和9倍。共晶结构还显示化合物23的喹唑啉酮环与异丙基苯环的构象呈垂直取向，由于邻位的双取代造成的阻转异构，存在光学异构体，经色谱拆分和测定活性发现R-23为优映体，抑制细胞活性的IC50=0.130 μmol·L-1，显著高于S-异构体。

3.2 结构优化

进一步通过在喹唑啉酮的7位引入大疏水基团、在哌嗪环的2′位作甲基取代和母核8位元素CH作N等排变换对活性的影响。

 

 

 

化合物R-32的过膜性显著提高，而且溶解度也提高了，生物利用度达到33%。将R-32的取代基变换为氟、氯、羟基，活性和药代性质的综合效应都不如R-32，提示结构的优化需要在活性和成药性之间作调整。

3.3 解决阻转异构的困惑

化合物32的光活体在25℃逐渐消旋化，半衰期为8天，转化自由能垒∆G≠=26 kcal·mol-1，所以这对于将R-32研发成药物是个障碍。解决的办法是变换结构，途径有3个：（1）提高构型转化的能垒，使活化自由能ΔG≠提高到30 kcal·mol-1，这样在室温下能以稳定的构型存在；（2）将转化能垒降低到20 kcal·mol-1，成为容易转化的混合物，研发成消旋体；（3）制备对称的取代基，消除手性轴。为此，采用两种方法研究具有阻转异构的化合物转换构型的能垒。设计合成了一系列衍生物并测定活性。

 

 

 

化合物46、47和48取代的对称性化合物活性都很强，而且也阻止了手性键的旋转。

3.4 高活性化合物的体内活性

对活性较好的5个化合物（36、43、46、47、48）进行药动学评价，它们的半衰期、清除率和血浆蛋白结合率（或表征为游离的化合物的份额）相差不多，但对小鼠的口服生物利用度（F）不同，36与43的F值相近，而其他3个的吸收性差。化合物36小鼠灌胃10mg·kg-1的最大血药浓度（Cmax）是IC50的4.5倍，43为1.5倍，提示36的体内活性强于43。所以优选出36是高活性化合物中药代性质优良的化合物。

 

 

3.5 生物药剂学性质的优化

化合物36的胜出是将苯并环换作吡啶并环，提高了该片段与“神秘”腔穴的结合力，为了提高其物化和生物药剂学性质，对吡啶并环的氯与氟原子进行变换，苯环用吡啶环变换，合成的化合物结构与性质评定如下表。

 

 

 

结果表明，化合物53～55的溶解性都提高，53的细胞活性略有降低，但过膜性和生物利用度都显著的提高，是个突出的优化分子。

4 候选物的确定

R-53的体内药效学表明，灌胃移植MIA PaCa细胞的裸鼠模型，在10mg·kg-1剂量下显著抑制ERK的磷酸化，进而评价了剂量-时间的药效/药代的关系，以及对动物安全性试验，证明R-53是选择性KRAS抑制剂，经系统的临床前研究后，定名为索托拉西（sotorasib, AMG510）于2018年开始临床研究，历时三年后基于II期开展的名为CodeBreaK100的临床研究，对126例KRASG12C变异的中晚期肺癌在免疫疗法和化疗无效的患者表明应答率为37%，中位应答时间10个月，88%患者症状明显改善，于2021年5月28日经美国FDA批准上市。

 

 

5 小结

在非小细胞肺癌的治疗中，EGFR、ALK、ROS1等靶点早已被一一攻克，只有KRAS基因让人束手无策。KRAS药物研发艰难进展挫败了很多科学家，有人甚至认为KRAS根本无法成为药物的靶点，存在KRAS突变的患者无药可医！但安进迎难而上，打破了KRAS靶向药物的难成药性问题，使索托拉西成为了这一领域的首创药物，让人类终于在KRAS的铜墙铁壁上凿出了一道光。